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    探究ARGs在废水处理系统中分布特征和去除情况
    时间:2018-10-10

      由于抗生素的广泛使用乃至滥用, 环境中残留的抗生素对自然环境中的微生物群落产生了选择性压力, 使得抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在环境中持久存在并广泛传播.目前ARGs已经成为了学术界的研究热点, 大量研究表明ARGs广泛存在于自然水环境中, 如河流、湖泊乃至海洋.废水处理系统(wastewater treatment plants, WWTPs)是污染治理体系中的一个重要环节, 它汇集了人类生活和生产产生的大量生活污水、医疗污水和工业废水等, 被认为是自然水环境中ARGs污染的重要点源, 且促进了ARGs的诱导和迁移, 因此, ARGs在不同类型的废水处理系统中的分布特征得到了广泛关注.制药废水处理系统(pharmaceutical WWTPs, PWWTPs)的进水中往往含有高浓度的抗生素及生产原料和中间体, 对生物处理单元的微生物群落形成高强度选择性压力, 为ARGs在污水中的持久存在和传播扩散提供了有利条件, 一些研究证实制药废水处理系统的出水中ARGs的浓度高于市政污水处理系统的出水.制药废水处理后往往排入下水道, 与其他污水(主要包括未经处理的生活污水和经过处理的其它工业废水)合并后再进入综合性废水处理系统(integrated WWTPs, IWWTPs), 进行统一处理后再排入水环境中.因此, 为了保护自然水生态安全, ARGs在制药废水和综合性两级废水处理系统中的分布特征和去除效率应给予高度关注.

      本研究选取了浙江省某精细化工园区内一家药业集团的制药废水处理系统和接纳该制药废水处理系统出水的综合性废水处理系统, 沿两级废水处理工艺流程采集污水和污泥样品, 以8类共28种ARGs作为目标基因进行定性检测, 并对高频率检出的7种ARGs和16S rRNA进行定量检测, 分析ARGs在具有上、下游关系的两座废水处理系统中的分布特征和去除效果, 探索ARGs的去除机制.

      1 材料与方法1.1 两级废水处理系统简介

      选取浙江省某精细化工园区的两座废水处理系统为研究对象, 它们分别是药业集团的废水处理系统(PWWTP)和园区综合性废水处理系统(IWWTP).该药业集团是化学合成医药原料和兽药原料的生产商, 主导产品为喹诺酮类抗菌药、大环内酯类抗菌药等抗生素类药物, 其中盐酸环丙沙星、恩诺沙星、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素等产品在全球市场上占据优势地位.该公司产生的废水是典型的制药废水, 有机污染物浓度高(COD可达5000 mg ·L-1), 水质波动大, 可生化性较差.该公司的废水处理系统采用A2O工艺, 设计处理能力为2400 m3 ·d-1, 实际处理水量约为1000 m3 ·d-1.制药废水经处理后排入园区下水道, 与园区其它工业废水及周边生活污水混合(工业废水和生活污水的比例约为6 :4), 再进入园区综合性废水处理系统, 该处理系统主体工艺为氧化沟, 分厌氧段、缺氧段和好氧段运行, 设计处理能力为22.5万m3 ·d-1, 目前实际处理水量约为11.5万m3 ·d-1, 处理后出水排入临近海域.

      1.2 样品采集及预处理

      本研究的采样时间是2015年4月, 两座废水处理系统的工艺流程示意图和采样点见图 1, 采样点具体包括:进水(P-Inf和I-Inf)、缺氧池出水(P-Ax和I-Ax)、好氧池出水(P-Ox和I-Ox)和二沉池出水(P-Eff和I-Eff).厌氧池出水由于取样条件限制未取得.此外, 还采集了二沉池污泥样品(P-Slu和I-Slu).每个采样点采集了1 L水样, 并存放于预先清洗干净的无菌聚乙烯塑料瓶中, 冷藏运输回实验室后置于4℃保存.污泥样品存放于无菌的塑料袋中, 冷藏运输回实验室后置于-20℃保存.

      图 1

    图 1 两座废水处理系统工艺流程和采样点示意

      1.3 样品DNA提取

      水样中DNA的收集采用0.22 μm混合纤维素酯滤膜(Millipore, 德国)过滤截留方法, 污泥样品则称取约0.2 g转移到洁净的收集管中, 随后二者均使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio, 美国)试剂盒进行DNA提取.提取完成后, 使用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000 (Thermo Fisher, 美国)对DNA浓度和纯度进行检测.

      1.4 普通PCR检测

      本研究选择了8类共27种ARGs进行定性检测, 具体包括7种四环素类ARGs(tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetQ、tetW), 4种磺胺类ARGs(sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、sul Ⅲ 、sulA), 3种甲氧苄啶ARGs(dfrA 1 、dfrA 12 、dfrA 13 ), 3种β-内酰胺类ARGs(ampC、blaSHV、blaPSE- 1 ), 2种大环内酯类ARGs(ermA、ermB), 3种氯霉素类ARGs(cat Ⅰ 、cat Ⅱ 、floR), 2种氨基糖苷类ARGs[aac(3)-Ⅱ a、aac(3)-Ⅳ ]和3种万古霉素ARGs(vanA、vanB、vanC).所用的引物序列和片段大小见表 1.本实验所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.普通PCR采用25 μL体系, 包含12.5 μL Premix Ex TaqTM Hot Start Version (TaKaRa, 中国); 各1 μL的上、下游引物; 1 μL的DNA模板; 9.5 μL ddH2O. PCR反应程序为: 95℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35个循环; 最后于72℃延伸10 min. PCR产物置于4℃保存, 并使用质量浓度为1%~2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测.

      表 1 PCR引物序列

      1.5 实时荧光定量PCR检测

      根据普通PCR定性检测的结果, 本研究对tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 、floR共7种ARGs及16S rRNA进行定量测定, 所用引物序列同表 1.采用SYBR Green Ⅰ方法、使用实时荧光定量PCR仪(BioRad CFX96 Touch, 美国)对各目标基因进行定量测定.定量PCR采用20 μL体系, 包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, 中国), 引物各0.4 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 8.2 μL.反应程序为: 95℃预变性1~2 min; 95℃变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环.溶解曲线程序为55~95℃, 每0.5℃读数一次, 期间停留30 s.测定时, 将标准质粒以10倍梯度稀释, 再根据质粒浓度计算得到标准质粒的拷贝数, 与通过实时荧光定量PCR测定得到的Ct值对应可做出标准曲线, 标准质粒的构建方法参照张衍等[24]的研究.各目标基因的标准曲线的线性相关系数在0.988~0.999之间.每个样品均设置3个平行样, 以减少误差.

      1.6 数据分析

      使用Excel 2016和Past3.0对数据进行分析, 相关性分析采用Pearson相关方法, P < 0.05(95%置信区间)被认为是显著相关.

      2 结果与讨论2.1 两座废水处理系统进水中ARGs存在情况

      在27种ARGs中, P-Inf中共检出了10种ARGs, I-Inf中共检出了15种ARGs, 结果如表 2所示.与P-Inf相比, I-Inf中的ARGs种类更为丰富.在检出的ARGs中, 四环素类和磺胺类ARGs的检出较为普遍, 甲氧苄啶类和大环内酯类ARGs有少量检出, 而β-内酰胺类ARGs和万古霉素类ARGs基本没有检出.检测的7种四环素类ARGs包含3种抗性机制为编码外排泵蛋白的tetA、tetB、tetC基因和4种编码核糖体保护蛋白的tetM、tetO、tetQ、tetW基因, 而检出的基因都属于后者, 这说明编码核糖体保护蛋白的四环素类ARGs更有可能存在于废水处理系统中.

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